实验摘要:
本研究旨在阐明 glypican-1 和 PECAM-1 在剪切诱导的内皮细胞一氧化氮生成中的作用,确定 PECAM-1 磷酸化是如何由流体剪切应力触发的,并在此过程中确定用于持续产生 NO 的上游剪切传感器。因此,本研究的总体目标是阐明剪切诱导的 NO 产生的机械转导途径,这将提高对心血管疾病进展的理解,并能够设计未来的治疗方法来挽救内皮功能障碍。
部分实验内容:
为了证实 PECAM-1 在力诱导 NO 产生中的作用,进行了 siRNA 转染以消耗 HUVEC 中的 PECAM1 mRNA 和蛋白质,并使用 6 孔旋转盘装置和平板系统施加20dynes/cm2的剪切应力。实时 PCR(qPCR)显示,与转染含有人类中不存在的随机序列的双链体(标记为“阴性对照 siRNA”并设置到 100%相比,转染 PECAM1 siRNA 的 HUVEC 的 PECAM1 基因表达显著降低(至 2%)。Glypican-1 表达不受 PECAM1 siRNA 的显着影响;与对照相比,转染 PECAM1 siRNA 的 HUVEC 中 GPC1 mRNA 没有显着变化。蛋白质印迹证实缺乏蛋白质产生,显示用 PECAM1 siRNA 转染的 HUVEC 的 PECAM-1 蛋白质表达显着降低(至 9%)。再次使用 DAF-2 DA 测量 NO,并将剪切力诱导的 DAF-2 T 水平标准化为每组的静态控制水平。与静态对照相比,流体剪切应力诱导阴性对照转染细胞中 NO 产生增加 2.51 倍。在 PECAM-1 敲低细胞中,静态 NO 产生没有显著变化,与阴性对照转染细胞相比,平均值为 0.94 倍。施加剪切应力30分钟后,PECAM-1敲除细胞没有显著增加NO生成,仅为平均增加1.36倍,这与静态PECAM-1敲低细胞中没有显著不同。
实验结果:
PECAM1 siRNA 转染阻断 HUVEC 中剪切力诱导的 NO 产生
实验结论:
剪切力诱导的 NO是通过硫酸乙酰肝素、 glypican-1 机械转导和 PECAM-1 磷酸化导致的 eNOS 激活和 NO 合成产生的。流体剪切应力最初由硫酸乙酰肝素蛋白多糖 glypican-1 感知,该信号被转导到 PECAM-1 蛋白的细胞内尾部。PECAM-1 被酪氨酸磷酸化激活。PECAM-1 激活触发 eNOS 的磷酸化和增加NO 生成。NO 通过细胞膜扩散出细胞以参与自分泌或旁分泌信号传导。
参考文章:Bartosch, A.M.W., Mathews, R., Mahmoud, M.M. et al. Heparan sulfate proteoglycan glypican-1 and PECAM-1 cooperate in shear-induced endothelial nitric oxide production. Sci Rep 11, 11386 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-021-90941-w
原文链接:https://doi.org/10.1038/s41598-021-90941-w
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